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      技術文章

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      人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)操作流程來啦
      時間:2022-03-28 點擊次數:165

      【預期用途】

      僅供科研使用,本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性。


      【檢測原理】

      本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)水平。用純化的人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入蛋白磷酸化酶2A(PP2A),再與HRP標記的蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白磷酸化酶2A(PP2A)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人蛋白磷酸化酶2A(PP2A)活性濃度。 


      【產品性能】

      1、物理性能

      試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝,無破損漏氣(如有漏氣,不影響使用)。

      2、劑量反應曲線線性

      標準品劑量反應曲線相關系數r值,大于等于0.9900。

      3、檢測范圍

      1.2U/L -45U/L。

      4、靈敏度

      檢出劑量不能小于0.3U/L 。

      5、精密度

      精密度用樣品測定值的變異系數CV 表示。CV(%) = SD/mean×100

      批內差:取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續測定20 次,分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

      批間差:選取3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定,每個樣本使用同一試劑盒重復測定10 次,分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

      批內差: CV<5.9%

      批間差: CV<8.1%

      6、回收率

      分別往5個不同樣本中添加已知濃度的目標蛋白,做回收實驗,得出回收率范圍和平均回收率。

      Sample TypeRange (%)Average Recovery (%)

      Tissue Lysates (n=5)93-10298

      Serum (n=5)91-10499

      EDTA plasma (n=5)95-109105

      Cell culture media (n=5)87-110101

      7、線性

      分別往5個樣本中添加已知濃度的目標蛋白,做回收實驗,得出回收率范圍及平均回收率。將5個樣本分別稀釋2倍,4倍,8倍,16倍做回收實驗,得出回收率范圍及平均回收率。

      Sample1:21:41:81:16

      Tissue Lysates (n=5)92-105%84-95%90-102%81-93%

      Serum (n=5)81-103%81-99%86-98%83-101%

      EDTA plasma (n=5)85-97%82-101%85-96%79-91%

      Cell culture media (n=5)83-105%89-112%81-106%82-110%

      8、特異性

      本試劑盒識別天然和重組 人蛋白磷酸化酶2A(PP2A),經檢測與其它相似物質無明顯交叉反應。由于受到技術及樣本來源的限制,不可能完成所有相關或相似物質交叉反應檢測,因此本試劑盒有可能與未經檢測的其它物質有交叉反應。

      9、穩定性

      經測定,試劑盒在有效期內務必按推薦溫度保存,活性降低率小于5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響,實驗室的環境條件需盡量保持一致,尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。


      【操作步驟】

      1.標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

      圖片1.png


      2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

      3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

      4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

      5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

      6.加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。 

      7.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

      8.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

      9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10-20分鐘。

      10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

      11.測定:以空白孔調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。




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